कोरोनाभाइरस प्रतिकृति-ट्रान्सक्रिप्शन जटिल: nsp9 मा संरक्षित साइटहरूमा NiRAN-RdRp सबयुनिटहरूको महत्त्वपूर्ण र चयनात्मक NMPylation

स्ट्यानफोर्ड युनिभर्सिटी स्कूल अफ मेडिसिन, स्ट्यानफोर्ड युनिभर्सिटी, क्यालिफोर्निया, 25 डिसेम्बर, 2020 मा अनुमोदित (अक्टोबर 25, 2020 मा समीक्षा गरिएको) पिटर सरनोद्वारा सम्पादन गरिएको।

हामी कोरोनाभाइरस-ट्रान्सक्रिप्शन कम्प्लेक्सको प्रतिकृतिमा सब्युनिटहरू बीचको अन्तरक्रिया रिपोर्ट गर्छौं, जुन प्रतिकृति र विकासवादी संरक्षणको लागि आवश्यक छ।हामीले प्रमाण प्रदान गर्यौं कि nsp12 सँग सम्बन्धित NiRAN डोमेन ट्रान्समा nucleoside monophosphate (NMP) ट्रान्सफरेज गतिविधि छ, र nsp9 (एक आरएनए बाइन्डिङ प्रोटीन) लाई यसको लक्ष्यको रूपमा पहिचान गर्‍यौं।NiRAN ले Mn2+ आयनहरू र आसन्न संरक्षित Asn अवशेषहरूमा भर पर्ने प्रतिक्रियामा संरक्षित nsp9 एमिनो टर्मिनसमा NMP moiety को सहसंयोजक संलग्नतालाई उत्प्रेरित गर्दछ।यो पत्ता लाग्यो कि NiRAN गतिविधि र nsp9 NMPylation कोरोनाभाइरस प्रतिकृतिको लागि आवश्यक छ।डेटाले हामीलाई नेस्टेड भाइरस इन्जाइम मार्करको यस गतिविधिलाई आरएनए भाइरसहरूको वर्गमा आरएनए संश्लेषणको प्रारम्भ कार्यात्मक र विकासात्मक रूपमा सुसंगत रहेको परिकल्पनामा अघिल्लो अवलोकनहरूमा लिङ्क गर्न अनुमति दिन्छ।

Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, र 12 अन्य परिवारहरू) को RNA-निर्भर RNA पोलिमरेज (RdRps) पोलीप्रोटिनबाट निस्केको गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (nsp) मा एमिनो-टर्मिनल (N-टर्मिनल) डोमेनसँग जोडिएको छ, जसलाई NiRAN भनिन्छ। 1ab भाइरल मुख्य प्रोटीज (Mpro) बाट बनेको छ।पहिले, धमनी भाइरस NiRAN-RdRp nsp को आफ्नै GMPylation/UMPylation गतिविधि रिपोर्ट गरिएको थियो, र यो (हाल अज्ञात) भाइरस र/वा सेल बायोपोलिमराइजेशन चीजहरूमा न्यूक्लियोसाइड मोनोफोस्फेट (NMP) को स्थानान्तरणको लागि एक क्षणिक उत्पन्न गर्न सुझाव दिइएको थियो।यहाँ, हामी देखाउँछौं कि कोरोनाभाइरस (मानव कोरोनाभाइरस [HCoV]-229E र Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) मा Mn2+-निर्भर NMPylation गतिविधि छ, जुन Mpro-mediated nsp9 को गठन मार्फत nsp9 बाट व्युत्पन्न गरिएको छ। एन-टर्मिनल फ्ल्याङ्किङ एनएसपीएस प्रोटियोलिटिक रूपमा रिलीज गरिएको छ, फस्फोरामिडेट एनएसपी९ को एन-टर्मिनलमा प्राथमिक अमाइन (N3825) मा बाँधिएको छ।युरिडिन ट्राइफोस्फेट यस प्रतिक्रियामा मनपर्ने न्यूक्लियोटाइड हो, तर एडेनोसिन ट्राइफोस्फेट, ग्वानोसिन ट्राइफोस्फेट, र साइटिडाइन ट्राइफोस्फेट पनि उपयुक्त सह-सब्सट्रेटहरू हुन्।पुन: संयोजक कोरोनाभाइरस nsp9 र nsp12 प्रोटीनहरू र आनुवंशिक रूपमा इन्जिनियर गरिएको HCoV-229E म्युटेन्टहरू प्रयोग गरी उत्परिवर्तन अध्ययनहरूले NiRAN- मध्यस्थता nsp9 NMPylation र सेल संस्कृतिमा भाइरस प्रतिकृतिको लागि आवश्यक अवशेषहरू निर्धारण गर्यो।डाटाले NiRAN सक्रिय साइट अवशेषहरूको भविष्यवाणी पुष्टि गर्‍यो र nsp9 NMPylation र भिट्रोमा भाइरस प्रतिकृतिमा nsp9 N3826 अवशेषहरूको महत्त्वपूर्ण भूमिका निर्धारण गर्‍यो।यो अवशेष संरक्षित N-टर्मिनल NNE ट्रिपेप्टाइड अनुक्रमको अंश हो र कोरोनाभाइरस परिवारमा nsp9 र यसको homologs को एक मात्र अपरिवर्तनीय अवशेष साबित भयो।यस अध्ययनले अन्य नेस्टेड भाइरसहरूको NMPylation गतिविधिको कार्यात्मक अध्ययनको लागि ठोस आधार प्रदान गर्दछ र एन्टिभाइरल औषधिहरूको विकासको लागि सम्भावित लक्ष्यहरू प्रस्ताव गर्दछ।

Nidovirales पोजिटिभ-स्ट्र्यान्डेड RNA भाइरसले विभिन्न प्रकारका कशेरुका र इन्भर्टेब्रेट्सलाई संक्रमित गर्छ (1, 2)।अर्डरमा हाल 14 परिवारहरू (3) समावेश छन्, जसमध्ये कोरोनाभाइरस परिवारलाई गत 20 वर्षहरूमा व्यापक रूपमा अध्ययन गरिएको छ।त्यस समयमा, तीनवटा जुनोटिक कोरोनाभाइरसहरू जनावरहरूको होस्टबाट देखा पर्‍यो र मानिसहरूमा गम्भीर श्वासप्रश्वासको संक्रमणको ठूलो मात्रामा प्रकोप निम्त्यायो।गम्भीर तीव्र संक्रामक रोगहरु को कारण लगातार pandemics सहित।रेस्पिरेटरी सिन्ड्रोम कोरोनाभाइरस २ (SARS-CoV-2) (4âââ7)।निडोभाइरसहरूले साझा जीनोम संगठन साझा गर्छन्, र झिल्ली-बाउन्ड रेप्लिकेशन-ट्रान्सक्रिप्शन कम्प्लेक्स (RTC) को सबयुनिट 5-?²-टर्मिनल दुई-तिहाई र भाइरस कणको मुख्य संरचनात्मक सब्युनिट, साथै केही सामानहरूमा एन्कोड गरिएको छ। ।प्रोटिन, जीनोमको 3??² अन्तमा इन्कोड गरिएको छ (1)।प्लानेरियन भाइरस (Monoviridae) (8) को एक परिवार बाहेक, सबै नेस्टेड भाइरसहरूले दुई ठूला ओपन रिडिंग फ्रेमहरू (ORF) ORF1a र ORF1b मा RTC सबयुनिटहरू इन्कोड गर्दछ, जुन को जीनोमिक आरएनएबाट अनुवाद गरिएको छ।ORF1a ले पोलीप्रोटिन (pp) 1a लाई एन्कोड गर्दछ, र ORF1a र ORF1b संयुक्त रूपमा pp1ab लाई इन्कोड गर्दछ।ORF1a द्वारा इन्कोड गरिएको मुख्य प्रोटीज (Mpro) को सामान्य सहभागिताको साथ, pp1a र pp1ab दुवै प्रोटियोलाइटिक रूपमा विभिन्न गैर-संरचनात्मक प्रोटीनहरू (nsps) मा प्रशोधन गरिन्छ, जसलाई 3CLpro पनि भनिन्छ, किनभने यसमा पिकोर्नभाइरसको 3Cpro सँग समरूपता छ। ९)यी nsps लाई ठूलो डायनामिक RTC मा जम्मा भएको मानिन्छ, जीनोमिक RNA (प्रतिकृति) र सबजेनोमिक RNA (ट्रान्सक्रिप्शन) को एक सेटको संश्लेषणलाई उत्प्रेरित गर्दछ, र ORF1b (10??) को डाउनस्ट्रीममा अवस्थित ORF को अभिव्यक्ति समन्वय गर्न प्रयोग गरिन्छ। ? 12)।

कोर RTC मा RNA-निर्भर RNA पोलिमरेज (RdRp) (13), सुपरफैमिली 1 helicase (HEL1) (14, 15) र धेरै RNA प्रशोधन इन्जाइमहरू समावेश छन्, जुन मुख्य रूपमा ORF1b मा इन्कोड गरिएका छन् र कोरोनाभाइरस परिवारमा यसमा nsp12-nsp16 र समावेश छन्। nsp9-nsp12 Arterioviridae परिवारमा (सन्दर्भ 10ââ 12 हेर्नुहोस्)।RdRp र HEL1 ले चराको गुँड भाइरसको दुई (एक-पाँचौं) संरक्षित डोमेनहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ र अन्य आरएनए भाइरसहरूमध्ये समानता छ।कोर प्रतिकृतिलाई pp1a को कार्बोक्सी-टर्मिनल (C-टर्मिनल) क्षेत्र, Mpro को डाउनस्ट्रीम (कोरोनाभाइरस nsp5 र धमनी भाइरस nsp4, क्रमशः) बाट जारी गरिएका धेरै साना एनएसपीहरू सहित अन्य सबयुनिटहरूले सहयोग गरेको विश्वास गरिन्छ।तिनीहरूसँग सीमित परिवार-विशेष सुरक्षा र विविध गतिविधिहरू छन् (सन्दर्भ 10-12 मा समीक्षा गरिएको)।

अपेक्षाकृत भर्खरै, सबै नेस्टेड भाइरसहरूमा RdRp को छेउमा रहेको एमिनो टर्मिनस (N-टर्मिनस) मा अद्वितीय अनुक्रम मोटिफ विशेषताहरू भएको डोमेन फेला पर्यो, तर अरू कुनै RNA भाइरसहरू (16) छैनन्।यसको स्थान र न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज (न्यूक्लियोसाइड मोनोफोस्फेट [NMP] ट्रान्सफरेज) गतिविधिको आधारमा, यस डोमेनलाई NiRAN (Nestvirus RdRp-सम्बन्धित न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज) नाम दिइएको छ।NiRAN-RdRp को दोहोरो-डोमेन संयोजनले Coronaviridae परिवारमा nsp12 र Arterioviridae परिवारमा nsp9 बनाउँछ, र अन्य nestoviridae मा, NiRAN-RdRp भाइरल पोलीप्रोटिनबाट स्वतन्त्र एनएसपीको रूपमा जारी हुने अपेक्षा गरिएको छ।कोरोनाभाइरसमा, NiRAN डोमेनले ?? 1/450 अवशेषहरू समावेश गर्दछ र लिङ्कर क्षेत्र (16?19) मार्फत C-टर्मिनल RdRp डोमेनसँग जोडिएको छ।Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) मा, पुन: संयोजक nsp9 ले Mn2+ आयन-निर्भर (आत्म) UMPylation र GMPylation गतिविधिहरू देखाउँदछ, जुन नेस्टोभाइरस, AN, BN र CN मा तीन संरक्षित अनुक्रम आधारहरूमा निर्भर गर्दछ अनुक्रममा अवशेषहरू।जहाँ N को अर्थ NiRAN) (16)।यी motifs को N-टर्मिनल flanking एक कम रूढ़िवादी motif preAN हो।यी मध्ये केही अवशेषहरू टाढा सम्बन्धित प्रोटीन किनेसहरूमा पनि संरक्षित छन्, जहाँ तिनीहरू न्यूक्लियोसाइड ट्राइफोस्फेट (NTP) बाइन्डिङ र उत्प्रेरक गतिविधि (20, 21) मा संलग्न देखाइएको छ।यस अवलोकनसँग अनुरूप, Pseudomonas syringae बाट pseudokinase SelO मा धेरै प्रमुख सक्रिय साइट अवशेषहरू भर्खरै प्रकाशित SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपर कम्प्लेक्ससँग भेला गर्न सकिन्छ।सुरक्षित गरिएको कोरोनाभाइरस NiRAN अवशेषहरू इलेक्ट्रोन माइक्रोस्ट्रक्चरमा सुपरइम्पोज गरिएको छ।पुन: संयोजक प्रोटीन (17)।यो अनुमान गरिएको छ कि दस्तावेजित (सेल्फ) U/GMPylation ले NMP लाई (हाल अज्ञात) सब्सट्रेट (16) मा स्थानान्तरण गर्न एक क्षणिक अवस्था उत्पादन गर्नेछ, र NiRAN र प्रोटीन किनेज (17, 19) बीचको संरचनात्मक समानता (17, 19)) परिकल्पना हो। NiRAN ले अन्य प्रोटीनहरू परिमार्जन गर्दछ।

नेस्टेड भाइरसहरूसँग यसको अद्वितीय र अनुपम व्यवस्थित सम्बन्ध र RdRp बाट आनुवंशिक पृथक्करण सहित धेरै सुविधाहरूले NiRAN लाई नेस्टेड भाइरसहरूको लागि एक उचित प्रमुख नियामक इन्जाइम बनाउँछ, जुन तिनीहरूको उदय र पहिचानको लागि महत्वपूर्ण छ।पहिले, जीनोम/सबजेनोमिक अनुवाद वा प्रतिकृति/ट्रान्सक्रिप्शन विनियमित गर्न NiRAN समावेश गर्ने तीन सम्भावित कार्यहरू बोलाइन्छ।समयमा उपलब्ध दुर्लभ र अपूर्ण डाटालाई विचार गर्दा, प्रत्येक प्रकार्यका फाइदा र बेफाइदाहरू छन् (१६)।यस अनुसन्धानमा, हामी दुई जेनेराको प्रतिनिधित्व गर्ने कोरोनाभाइरसहरूको बायोकेमिकल र रिभर्स आनुवंशिक अध्ययनहरू संयोजन गर्ने लक्ष्य राख्छौं, र यस रहस्यमय क्षेत्रको अन्तरदृष्टि प्राप्त गर्नका लागि हाम्रो निष्कर्षहरू कोरोनाभाइरस परिवारको प्राकृतिक उत्परिवर्तनको विकासवादी पृष्ठभूमिमा राख्छौं।हामी RTC मा प्राकृतिक लक्ष्यहरूको पहिचान मार्फत NiRAN को बुझाइमा प्रमुख प्रगतिहरू रिपोर्ट गर्छौं, जसले (तीन उपलब्ध परिकल्पनाहरू मध्ये) नेस्टेड भाइरस RNA को संश्लेषण सुरु गर्न यस डोमेनको भूमिकामा योगदान गर्दछ।यो अनुसन्धानले भाइरस होस्ट इन्टरफेसमा NiRAN को अन्य भूमिकाहरूको लागि सम्भावनाहरू पनि खोल्छ।

कोरोना भाइरस nsp12-सम्बन्धित NiRAN डोमेनको इन्जाइम्याटिक गुणहरू चित्रण गर्न, हामीले C-टर्मिनसमा His6 ट्यागको साथ, E. coli मा मानव कोरोनाभाइरस 229E (HCoV-229E) nsp12 को पुन: संयोजक रूप उत्पादन गर्यौं, र संयुक्त [α32-P] सँगको प्रोटीन MnCl2 को उपस्थितिमा NTP सँगसँगै इन्क्युबेट गर्नुहोस् जसरी सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिएको छ।प्रतिक्रिया उत्पादनको विश्लेषणले nsp12 (106 kDa) को साथ माइग्रेट गर्ने रेडियोलेबल प्रोटीनको उपस्थितिलाई संकेत गर्‍यो, यसले संकेत गर्दछ कि कोरोनाभाइरस nsp12 ले कोभ्यालेन्ट प्रोटीन-NMP एडक्ट्सको गठनलाई उत्प्रेरित गर्दछ, प्राथमिकतामा uridine monophosphate (UMP) (AndA) सँग बनाइएको छ। ख)।मात्रात्मक विश्लेषणले देखाएको छ कि अन्य न्यूक्लियोटाइड्सको तुलनामा, UMP समावेशको संकेत तीव्रता 2 देखि 3 गुणा बढ्यो (चित्र 1C)।यो डेटा कोरोनाभाइरस (16) को NiRAN डोमेनको भविष्यवाणी गरिएको NMP ट्रान्सफरेज गतिविधिसँग मिल्दोजुल्दो छ, तर यसले कोरोनाभाइरसको NiRAN डोमेन र धमनी भाइरसको न्यूक्लियोटाइड प्राथमिकताहरू फरक छन् भनेर संकेत गर्दछ।

HCoV-229E nsp12 को स्व-NMPylation गतिविधि।(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 6 mM MnCl2 को उपस्थितिमा तोकिएको [α-32P] NTP सँग ३० मिनेटसम्म इन्क्युटेड गरिएको थियो (विवरणका लागि सामग्री र विधिहरू हेर्नुहोस्)।प्रतिक्रिया उत्पादनहरू SDS-PAGE द्वारा छुट्याइयो र Coomassie शानदार नीलो संग दाग गरियो।(B) रेडियोलेबल गरिएको प्रोटीन फस्फोरस इमेजिंग द्वारा कल्पना गरिएको छ।nsp12-His6 र प्रोटीन आणविक मास मार्करहरू (kilodalton मा) को स्थिति A र B मा देखाइएको छ। (C) रेडियोधर्मी संकेतको तीव्रता (मतलब ± SEM) तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट निर्धारण गरिएको थियो।*P≤0.05।संकेत शक्ति (प्रतिशत) UTP सम्बन्धित छ।

यद्यपि NiRAN-सम्बन्धित इन्जाइम गतिविधिहरू सेल संस्कृति (16) मा EAV र SARS-CoV को प्रतिकृतिको लागि आवश्यक देखाइएको छ, विशिष्ट NiRAN प्रकार्य र सम्भावित लक्ष्यहरू अझै निर्धारण गरिएको छैन।हालै रिपोर्ट गरिएको NiRAN र प्रोटिन किनेज-जस्तो फोल्डहरू (17, 22) भएको प्रोटीनहरूको परिवार बीचको संरचनात्मक समानताले हामीलाई NiRAN ले अन्य प्रोटीनहरूको NMPylation लाई उत्प्रेरित गर्छ भन्ने परिकल्पना परीक्षण गर्न प्रेरित गर्‍यो।हामीले HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) द्वारा इन्कोड गरिएको गैर-संरचनात्मक प्रोटीनहरू सहित सम्भावित समरूप लक्ष्यहरूको सेट उत्पन्न गर्‍यौं, प्रत्येकमा C-terminal His6 ट्याग (SI परिशिष्ट, तालिका S1) , र। nsp12 को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा यी प्रोटीनहरूलाई [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) सँग इन्क्युबेट गर्नुहोस्।ई. कोलाईमा उत्पादित बोवाइन सीरम एल्बुमिन र MBP-LacZα फ्यूजन प्रोटीनले नियन्त्रणको रूपमा काम गर्यो (चित्र 2A, लेनहरू 1 देखि 7)।रेडियोलेबल गरिएको प्रोटीन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पोल्याक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (SDS-PAGE) र अटोरेडियोग्राफी द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो, र यो nsp12 र nsp9 समावेश प्रतिक्रियामा एक बलियो रेडियोधर्मी संकेत थियो।संकेतको स्थिति nsp9 को आणविक द्रव्यमानसँग मेल खान्छ, nsp9 को nsp12-मध्यस्थता UMPylation को संकेत गर्दछ (चित्र 2B, ट्र्याक 7)।कुनै अन्य परीक्षण प्रोटीनहरू UMPylated भएको फेला परेन, जसले हामीलाई nsp9 nsp12 को एक विशिष्ट सब्सट्रेट हो भनेर निष्कर्षमा पुर्यायो।चित्र 1 मा देखाइएको स्व-NMPylation डेटा संग संगत, nsp12 ले सबै चार NMPs लाई nsp9 मा स्थानान्तरण गर्न सक्षम छ, यद्यपि दक्षता फरक छ, UMP> एडेनोसिन मोनोफोस्फेट (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMPphosphate) तस्वीर)।3 A र B)।यस परखमा प्रयोग गरिएका सर्तहरू अन्तर्गत (प्रतिक्रिया र एक्सपोजर समय छोटो पार्नुहोस्, nsp12 को एकाग्रता कम गर्नुहोस्; सामग्री र विधिहरू), nsp12 को स्व-NMPylation पत्ता लगाउन सकिएन (चित्र 2B, लेन 7, र चित्र 1B तुलना गर्नुहोस्), जुन। प्रभावकारी साबित भयो (र धेरै राउन्डहरू) UMP nsp12 बाट nsp9 मा सारियो।UMP ट्रान्सफरेज गतिविधिलाई Mn2+ आयनको उपस्थिति चाहिन्छ, जस्तै चित्र 3C मा देखाइएको छ, जबकि Mg2+ को उपस्थितिमा मात्र न्यूनतम UMP ट्रान्सफरेज गतिविधि अवलोकन गरिएको थियो, र परीक्षण गरिएका अन्य दुई divalent cations को उपस्थितिमा कुनै गतिविधि छैन।यस्तै डाटा NMPylation assays मा साइटिडाइन ट्राइफोस्फेट (CTP), guanosine triphosphate (GTP), र adenosine triphosphate (ATP) (SI परिशिष्ट, चित्र S1) समावेश गरिएको थियो।

HCoV-229E nsp12-मध्यस्थता nsp9 को UMPylation।प्रोटीन सब्सट्रेटहरूको एक श्रृंखला (बोवाइन सीरम albumin, MBP-lacZα, र ORF1a द्वारा एन्कोड गरिएको C-टर्मिनल His6 सँग लेबल गरिएको HCoV-229E nsps को एक श्रृंखला सहित) HCoV-229E nsp12-Media6⁺ को UMPylation गतिविधि मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। प्रोटिन।सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार nsp12 को अनुपस्थिति (A) वा उपस्थिति (B) मा 10 मिनेटको लागि [α-32P] UTP सँग प्रोटिन इन्क्युब्याट गर्नुहोस्।A र B को शीर्षमा, SDS-polyacrylamide जेल Coomassie Brilliant Blue को दाग देखाइएको छ, र A र B को तल, सम्बन्धित अटोरेडियोग्रामहरू देखाइएको छ।प्रोटीन आणविक मास मार्करको स्थिति (किलोडाल्टनमा) बाँयामा दिइएको छ।nsp12-His6 (B, top) को स्थिति र nsp9-His6 (B, लेन 7) सँग nsp12-His6 को इन्क्युबेशनको समयमा अवलोकन गरिएको रेडियोएक्टिभ संकेत पनि संकेत गरिएको छ, जसले संकेत गर्दछ कि [α-32P] UMP लाई nsp9-His6 (12.9 kDa), जुन परीक्षण गरिएको अन्य प्रोटीनहरूको लागि अवलोकन गरिएको थिएन।

HCoV-229E NiRAN-मध्यस्थता nsp9 NMPylation को बायोकेमिकल र भाइरोलोजिकल विशेषता।(A र B) प्रतिक्रियामा प्रयोग गरिएको न्यूक्लियोटाइड सह-सब्सट्रेटको भूमिका।Nsp12-His6 र nsp9-His6 मानक NMPylation परखमा विभिन्न [α-32P] NTPs को उपस्थितिमा मिश्रित र इन्क्युबेटेड छन्।(A, शीर्ष) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE द्वारा विभाजित।(ए, तल) जेल को समान क्षेत्र को Autoradiograph।(B) नामित न्यूक्लियोटाइड कोफ्याक्टरको उपस्थितिमा सापेक्ष गतिविधि (मतलब ± SEM) तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट निर्धारण गरिन्छ।*P≤0.05।(C) धातु आयनहरूको भूमिका।देखाइएको मानक NMPylation परीक्षण [α-32P] UTP र विभिन्न धातु आयनहरूको उपस्थितिमा, प्रत्येक 1 mM को एकाग्रताको साथ।C मा, माथि, Coomassie स्टेन्ड nsp9-His6 देखाइएको छ, र C मा, तल, सम्बन्धित अटोरेडियोग्राफी देखाइएको छ।लेबल गरिएको प्रोटिनको साइज (किलोडाल्टनमा) A र C को बायाँतिर देखाइएको छ। (D) निर्दिष्ट एमिनो एसिड प्रतिस्थापन बोक्ने HCoV-229E nsp12-His6 को उत्परिवर्ती रूप [α-32P]UTP मा छ, वर्णन गरिए अनुसार। सामग्री र विधिहरूमा।NMPylation प्रतिक्रिया मा उत्पादित radiolabled nsp9-His6 फस्फोरिलेसन इमेजिङ (D, शीर्ष) द्वारा पत्ता लगाइएको छ।जंगली-प्रकार (wt) प्रोटीनसँग तुलना गरिएको सापेक्ष गतिविधि D मा देखाइएको छ, र तल तीन स्वतन्त्र प्रयोगबाट औसत (±SEM) को रूपमा लिइन्छ।तारा चिन्हहरूले गैर-संरक्षित अवशेषहरूको प्रतिस्थापनलाई संकेत गर्दछ।(E) p1 कोशिकाहरूको कल्चर सुपरनेटान्टमा भाइरस टाइटर प्लेक परखद्वारा संक्रमण भएको 24 घण्टा पछि प्राप्त भयो।इन्जिनियर गरिएको HCoV-229E म्युटेन्टको NiRAN डोमेनमा कोडोन प्रतिस्थापनहरू संकेत गरिएका छन् (अवशेष नम्बरिङ pp1ab मा तिनीहरूको स्थितिमा आधारित छ)।प्रतिकृति-कम RdRp सक्रिय साइट उत्परिवर्ती nsp12_DD4823/4AA नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।

NiRAN को सक्रिय साइटको गहिरो बुझाइ प्राप्त गर्न र nsp9-विशिष्ट NMP ट्रान्सफरेजको गतिविधिसँग सम्बन्धित अवशेषहरू निर्धारण गर्न, हामीले उत्परिवर्तन विश्लेषण गर्यौं, जसमा हामीले NiRAN AN, BN र CN motifs ( 16) यो अला (SI परिशिष्ट, चित्र S2) हो।थप रूपमा, रूढिवादी Arg-to-Lys वा Lys-to-Arg प्रतिस्थापनहरूको प्रभाव दुई अवस्थामा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।एक (नकारात्मक) नियन्त्रणको रूपमा, कोरोनाभाइरस र अन्य नेस्टेड भाइरसहरूको NiRAN डोमेनमा संरक्षित नभएका वा कम भएका अवशेषहरूलाई Ala ले प्रतिस्थापन गरिन्छ। K4116A (मोटिफ preAN मा), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (मोटिफ) लाई प्रतिस्थापन गर्दै। BN) र D4280A (CN) ले nsp12 मार्फत nsp9 NMPylation लाई उल्लेखनीय रूपमा घटाउँछ वा हटाउँछ, जबकि रूढ़िवादी प्रतिस्थापन (R4178K), K4116R) ले आफ्नो गतिविधिको 60% र 80% कायम राख्छ, जसले तिनीहरूको सम्बन्धित पक्षमा प्रतिबन्धहरूको विश्रामलाई संकेत गर्दछ। चेन भौतिक रसायनिक रूपमा संवेदनशील छ (चित्र 3D)।धेरै अन्य संरक्षित अवशेषहरू E4145A, D4273A, F4281A र D4283A प्रतिस्थापन गर्नु धेरै कम हानिकारक छ, र nsp9 UMPylation मात्र कम हुन्छ।समान परिणामहरू अन्य NTPs (चित्र 3D र SI परिशिष्ट, चित्र S3) समावेश nsp9 NMPylation प्रतिक्रियाहरूमा प्राप्त गरिएको थियो, विशिष्ट एमिनो एसिड प्रतिस्थापनहरूमा पर्यवेक्षित प्रभावहरू प्रयोग गरिएको न्यूक्लियोटाइड सह-सब्सट्रेटको प्रकारबाट स्वतन्त्र छन् भनेर पुष्टि गर्दै।अर्को, हामीले सेल संस्कृतिमा कोरोनाभाइरसको प्रतिकृतिमा यी nsp12 प्रतिस्थापनहरूको सम्भावित प्रभावको परीक्षण गर्‍यौं।यस अन्तको लागि, हामीले 5 -7 कोशिकाहरू ट्रान्सक्राइब गर्नको लागि पुन: संयोजक भ्याक्सिनिया भाइरस (23, 24) मा क्लोन गरिएको उपयुक्त आनुवंशिक रूपमा ईन्जिनियर गरिएको पूरक DNA (cDNA) टेम्प्लेटहरू प्रयोग गर्यौं।यी कोशिकाहरूमा उत्पादित संक्रामक भाइरस सन्तानको टाइटरेशनले देखाएको छ कि अधिकांश HCoV-229E NiRAN उत्परिवर्तीहरू सम्भव थिएनन् (चित्र 3E)।गैर-व्यवहार्य भाइरल उत्परिवर्तीहरूको समूहमा भिट्रो (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) मा NMP ट्रान्सफरेज गतिविधि हटाउन वा उल्लेखनीय रूपमा कम गर्न देखाइएको विकल्पहरू समावेश छन्, तर त्यहाँ दुई अन्य विकल्पहरू छन् (K4116R, E414A) % आरक्षित?तिनीहरूको इन भिट्रो NMPylation गतिविधिले थप प्रतिबन्धहरू समावेश भएको सुझाव दिन्छ।त्यस्तै गरी, दुई अन्य म्युटेसनहरू (R4178K, F4281A) जसले NiRAN को इन भिट्रो NMPylation गतिविधिमा मध्यम कमी ल्याउने कारणले प्रत्यक्ष भाइरसहरू उत्पादन गर्यो, तथापि, यी भाइरसहरूले प्रतिकृति मार्फत टाइटरहरूलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाए।चित्र 3D मा देखाइएको इन भिट्रो गतिविधि डेटा संग संगत, कोरोनाभाइरस र/वा अन्य नेस्टेड भाइरस (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) मा संरक्षित नभएका अन्य चार अवशेषहरू प्रतिस्थापन गर्दै (8, 16) व्यवहार्य भाइरसहरू उत्पादन गरे पनि। जंगली-प्रकारको भाइरस (चित्र 3E) को तुलनामा मध्यम रूपमा घटाइएको टिटर।

NiRAN-मध्यस्थ NMP ट्रान्सफरेज गतिविधि सक्रिय RdRp डोमेनमा निर्भर छ कि छैन भनेर अध्ययन गर्न, RdRp motif C मा divalent धातु आयनहरू (11) को समन्वयमा संलग्न दुई संरक्षित Asp अवशेषहरू Ala द्वारा प्रतिस्थापित गरियो। परिणामस्वरूप प्रोटीन nsp12_DD4823/4AA कायम रहन्छ। यसको nsp9 NMPylation गतिविधि, संकेत गर्दछ कि nsp12-मध्यस्थता in vitro nsp9 NMPylation गतिविधिलाई पोलिमरेज गतिविधि आवश्यक पर्दैन (SI परिशिष्ट, चित्र S4)।

nsp12 को लागि nsp9-विशिष्ट NMP ट्रान्सफरेज गतिविधि स्थापना गरेपछि, हामीले मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा NMP-nsp9 एडक्टलाई विशेषता गर्ने प्रयास गर्यौं।पुनः संयोजक HCoV-229E nsp9 को पूर्ण प्रोटीन मास स्पेक्ट्रमले 12,045 Da (चित्र 4A) मा शिखर देखायो।nsp12 को थप्दा nsp9 को गुणस्तर परिवर्तन भएन, nsp12 र nsp9 ले प्रयोग गरिएका सर्तहरूमा स्थिर जटिल बनाउँदैन (चित्रा 4A)।UTP र GTP को उपस्थितिमा, क्रमशः nsp9 र nsp12 भएको प्रतिक्रियाको द्रव्यमान मापनले UTP को प्रोटीन मास 306 Da सारियो, र GTP को प्रोटीन मास 345 Da सारियो, प्रत्येक nsp9 अणुले UMP वा GMP बाँध्छ भनेर संकेत गर्दछ। (चित्र 4) C र D)।यो अनुमान गरिएको छ कि NiRAN- मध्यस्थ nsp9 NMPylation को लागि आवश्यक ऊर्जा NTP हाइड्रोलाइसिस र पाइरोफोस्फेट रिलीजबाट आउँछ।यद्यपि यो प्रतिक्रियामा nsp12 (Enzyme) भन्दा nsp9 (लक्ष्य) को 10-गुना मोलर अधिक प्रयोग गरिएको थियो, nsp9 को लगभग पूर्ण NMPylation अवलोकन गरिएको थियो, nsp12 र nsp9 बीचको अन्तरक्रिया अल्पकालिक हुन्छ भनेर संकेत गर्दछ, र nsp12 ले अधिक nsp9 लाई NMPylate गर्न सक्छ। इन भिट्रो अणु।

nsp12 र UTP वा GTP को उपस्थितिमा nsp9 को एकल NMPylation।HCoV-229E nsp9 (SI परिशिष्ट, तालिका S1) (AD) को डिकन्भोल्युटेड पूर्ण प्रोटीन मास स्पेक्ट्रम देखाइएको छ।(A) nsp9 एक्लै, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP को उपस्थितिमा, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP को उपस्थितिमा।

nsp12 द्वारा UMPylated nsp9 अवशेषहरू निर्धारण गर्न, nsp9-UMP ट्रिप्सिनको साथ क्लीभ गरिएको थियो।परिणामस्वरूप पेप्टाइडहरू नैनो-उच्च प्रदर्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (HPLC) द्वारा अलग गरिएको थियो र ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) अनलाइन द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।बायोनिक सफ्टवेयर प्याकेज (प्रोटिन मेट्रिक्स) को प्रयोग गरेर डाटा विश्लेषणले N-टर्मिनल एमिनो एसिडको UMPylation देखाएको छ।यो म्यानुअल रूपमा पुष्टि गरिएको छ।पूर्ववर्ती पेप्टाइड [UMP]NNEIMPGK (SI परिशिष्ट, चित्र S5A) को ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रमले 421 m/z मा एक टुक्रा प्रकट गर्‍यो, जसले UMP ले nsp9 को अवशेष 1 मा बाँध्छ भनेर संकेत गर्दछ।

nsp9 को N-टर्मिनसमा, Asn Orthocoronavirinae (SI एपेन्डिक्स, चित्र S6) को सदस्यहरू बीच संरक्षित छ।यद्यपि हामी विश्वास गर्छौं कि N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइन नाइट्रोजन UMP को लागि सबैभन्दा सम्भावित स्वीकारकर्ता हो, हामीले N-टर्मिनलमा NMP बाध्यकारीको थप प्रमाण प्राप्त गर्ने निर्णय गर्यौं।यस कारणले गर्दा, HPLC द्वारा शुद्ध गरिएको गैर-NMPylated र NMPylated N-टर्मिनल पेप्टाइड nsp9 एसीटोन र सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइडको उपस्थितिमा व्युत्पन्न गरिएको थियो।यी अवस्थाहरूमा, केवल नि: शुल्क प्राथमिक एमिनहरू प्रोपाइल (25) सँग परिमार्जन गर्न सकिन्छ।अनुक्रम NNEIMPGK सँग N-टर्मिनल nsp9-व्युत्पन्न पेप्टाइडमा दुई प्राथमिक अमाइनहरू हुन्छन्, एउटा Asn को N-टर्मिनसमा र अर्को C-टर्मिनसमा Lys को साइड चेनमा।त्यसकारण, प्रोपाइल समूहहरू दुवै छेउमा प्रस्तुत गर्न सकिन्छ।गैर-NMPylated पेप्टाइड्स को निकालिएको आयन क्रोमेटोग्राम SI परिशिष्ट, चित्र S5B मा देखाइएको छ।अपेक्षित रूपमा, एन-टर्मिनल र सी-टर्मिनल (मोनो) प्रोपाइलेटेड (SI एपेन्डिक्स, चित्र S5B, माथिल्लो लेन) र डिप्रोपाइलेटेड पेप्टाइड्स (SI एपेन्डिक्स, चित्र S5B, तल्लो लेन) पहिचान गर्न सकिन्छ।यो ढाँचा nsp9 को NMPylated N-टर्मिनल पेप्टाइड को प्रयोग संग परिवर्तन हुन्छ।यस अवस्थामा, केवल C-टर्मिनल प्रोपाइलेटेड पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न सकिन्छ, तर N-टर्मिनल प्रोपाइलेटेड पेप्टाइडहरू र डिप्रोपाइलेटेड पेप्टाइडहरू पहिचान गरिएको छैन (SI परिशिष्ट, चित्र S5C), यसले सङ्केत गर्दछ कि UMP लाई N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनमा स्थानान्तरण गरिएको छ यसलाई रोक्न। परिवर्तन गर्न समूह।

अर्को, हामीले लक्ष्य-विशिष्ट अवरोधहरू परिभाषित गर्न nsp9 को N-टर्मिनसमा संरक्षित अवशेषहरूलाई (Ala वा Ser सँग) प्रतिस्थापन गर्छौं वा मेटाउँछौं।NiRAN ले nsp9 को N-टर्मिनल अवशेषको प्राथमिक अमाइनसँग nsp9-NMP एडक्ट बनाउँछ भनेर देखाउने हाम्रो MS डेटाको आधारमा, हामीले nsp9 NMPylation लाई nsp9 N-टर्मिनल रिलिज गर्न भाइरल मास्टर प्रोटीज (Mpro, nsp5) को आवश्यकता पर्छ भनेर परिकल्पना गर्यौं। यसको पोलीप्रोटिन अग्रदूत।यो परिकल्पना परीक्षण गर्न, हामीले E. coli मा nsp9 समावेश भएको एक पूर्ववर्ती प्रोटीन nsp7-11 उत्पादन गर्यौं र [α-32P] UTP (सामग्री र विधिहरू) को उपस्थितिमा मानक NMPylation परीक्षण प्रदर्शन गर्‍यौं।चित्र 5A (लेन 3) मा देखाइए अनुसार, अनकट nsp7-11 पूर्ववर्ती nsp12 सँग रेडियोलेबल गरिएको छैन।यसको विपरित, यदि nsp7-11 लाई पूर्ववर्तीबाट nsp9 (र अन्य nsps) जारी गर्न पुन: संयोजक nsp5 द्वारा क्लीभ गरिएको छ भने, nsp9 को साथ माइग्रेट गर्ने रेडियोलेबल प्रोटिन पत्ता लगाइन्छ, जसले हाम्रो निष्कर्षलाई पुष्टि गर्दछ कि NiRAN र N- सहसंयोजक nsp9-NMP विज्ञापनको चयनात्मक गठन। ।N-टर्मिनल Asn को टर्मिनल प्राथमिक अमाइन (pp1a/pp1ab मा स्थिति 3825)।यो निष्कर्ष nsp9 निर्माण प्रयोग गरेर प्रयोगहरू द्वारा समर्थित छ, जसमा N-टर्मिनसमा एक वा दुई अतिरिक्त अवशेषहरू छन्।दुवै अवस्थामा, nsp9 को NiRAN-मध्यस्थता UMPylation खारेज गरियो (SI परिशिष्ट, चित्र S7)।अर्को, हामीले nsp9 को N-टर्मिनलमा 3825-NNEIMPK-3832 पेप्टाइड अनुक्रमबाट मेटाइएको एक वा दुई Asn अवशेषहरूको साथ प्रोटीन उत्पादन गर्यौं।दुबै अवस्थामा, nsp9 UMPylation पूर्ण रूपमा अवरुद्ध गरिएको थियो (चित्र 5B), वास्तविक nsp9 N-टर्मिनसले NMP रिसेप्टरको रूपमा कार्य गर्दछ भन्ने थप प्रमाण प्रदान गर्दछ।

nsp9 को प्रोटियोलाइटिक प्रशोधन र nsp12-मध्यस्थता UMPylation मा N-टर्मिनल अवशेषहरूको भूमिका।(A) nsp9 UMPylation लाई नि:शुल्क nsp9 N-टर्मिनल चाहिन्छ।Nsp7-11-His6 पुन: संयोजक Mpro (nsp5-His6) को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा UTP युक्त NMPylation पत्ता लगाउने बफरमा 30 °C मा पूर्व-इन्क्युबेटेड हुन्छ।३ घण्टा पछि, सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार nsp12-His6 थपेर NMPylation परख सुरु गर्नुहोस्।nsp5-His6 (लेन 1) र nsp9-His6 (लेन 2) भएको प्रतिक्रियालाई नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।10 मिनेट पछि, प्रतिक्रिया समाप्त भयो र प्रतिक्रिया मिश्रण SDS-PAGE द्वारा अलग गरिएको थियो।प्रोटिन Coomassie ब्रिलियन्ट ब्लू (A, शीर्ष) संग दाग थियो।Nsp7-11-His6 पूर्ववर्ती र nsp5-His6 मध्यस्थता क्लीभेजको परिणामस्वरूप प्रशोधित उत्पादन दायाँमा देखाइएको छ।कृपया ध्यान दिनुहोस् (तिनीहरूको सानो आकारको कारणले) कि nsp7 र nsp11-His6 यस जेलमा पत्ता लगाउन सकिने छैन, र प्रतिक्रिया nsp5-His6 (लेन 1 र 4; nsp5-His6 को स्थिति ठोस सर्कल द्वारा संकेत गरिएको छ) को साथ पूरक छ। वा nsp9-His6 (लेन 2) ले अवशिष्ट अशुद्धताहरूको रूपमा MBP (खुला सर्कलहरूद्वारा संकेत गरिएको) को सानो मात्रा समावेश गर्दछ किनभने तिनीहरूलाई MBP फ्युजन प्रोटीन (SI परिशिष्ट, तालिका S1) को रूपमा व्यक्त गरिन्छ।(B) Nsp9-His6 भेरियन्टमा एक वा दुई N-टर्मिनल Asn अवशेषहरू छैनन् (pp1a/pp1ab मा स्थिति अनुसार अवशेषहरू संख्या) र शुद्ध र nsp12-His6 र [α-32P] UTP संग इन्क्युबेटेड छ।B, Coomassie सँग दाग भएको SDS-PAGE शीर्षमा देखाइएको छ, B, सम्बन्धित अटोरेडियोग्राफ तल देखाइएको छ।आणविक तौल मार्करको स्थिति (किलोडाल्टनमा) बायाँमा देखाइएको छ।(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-टर्मिनल संरक्षित अवशेषहरू Ala वा Ser द्वारा प्रतिस्थापित गरियो, र nsp12-His6 मध्यस्थता गरिएको UMPylation प्रतिक्रियामा प्रोटिनको समान मात्रा प्रयोग गरियो।प्रतिक्रिया उत्पादनहरू SDS-PAGE द्वारा छुट्याइयो र Coomassie Brilliant Blue (C, top), र radiolabed nsp9-His6 फस्फोरेसेन्स इमेजिङ (C, मध्य) द्वारा पत्ता लगाइएको थियो।जंगली-प्रकार (wt) प्रोटीनलाई सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गर्दै (100% मा सेट), सापेक्ष NMPylation गतिविधि (मतलब ± SEM) तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट गणना गरिएको थियो।(D) HCoV-229E जंगली-प्रकार Huh-7 कोशिकाहरूबाट संक्रमित Huh-7 कोशिकाहरूको p1 सेल कल्चर सुपरनेटान्टमा भाइरस टाइटरहरू, र nsp9 मा नामित एमिनो एसिड प्रतिस्थापनहरू बोक्ने म्युटेन्टहरू प्लेक परखद्वारा निर्धारण गरिएको थियो।प्रतिकृति-कम RdRp आकृति C डबल उत्परिवर्ती DD4823/4AA नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।

nsp9 को N-टर्मिनस (विशेष गरी स्थिति 1, 2, 3, र 6) Orthocoronavirinae subfamily (SI परिशिष्ट, चित्र S6) को सदस्यहरू बीच धेरै संरक्षित छ।nsp12-मध्यस्थता nsp9 NMPylation मा यी अवशेषहरूको सम्भावित भूमिका अध्ययन गर्न, nsp9 को N-टर्मिनसमा लगातार दुई Asn अवशेषहरू Ala वा Ser (एक्लो वा संयोजनमा) द्वारा प्रतिस्थापित गरियो।जंगली-प्रकार nsp9 सँग तुलना गर्दा, Ala वा Ser सँग N3825 प्रतिस्थापन गर्दा nsp12- मध्यस्थ UMPylation (चित्र 5C) मा दुई गुणा भन्दा बढी कमी आयो।NMPylation N-टर्मिनल अवशेषको साइड चेनको सट्टा N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनमा हुन्छ भन्ने हाम्रो निष्कर्षसँग अनुरूप, हामीले N3825A र N3825S को प्रतिस्थापनको साथ महत्त्वपूर्ण अवशिष्ट NMPylation अवलोकन गर्यौं।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, यदि दोस्रो Asn लाई Ala वा Ser द्वारा प्रतिस्थापित गरिएको छ भने, nsp9 UMPylation अझ बलियो रूपमा घटाइन्छ (१० पटक भन्दा बढी), जबकि स्थिति 3, 4, र 6 मा Ala को प्रतिस्थापनले मात्र nsp9 UMPylation मा मध्यम प्रभाव पार्छ (चित्र 2)। )।5C)।समान परिणामहरू ATP, CTP वा GTP (SI परिशिष्ट, चित्र S8) प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।सामूहिक रूपमा, यी डेटाले nsp9 NMPylation मा N2826 (nsp9 मा स्थिति 2) को मुख्य भूमिकालाई संकेत गर्दछ।

nsp9 र NMPylation को N-टर्मिनस बीचको कार्यात्मक सम्बन्धको थप प्रमाण प्राप्त गर्नको लागि, हामीले कोरोनाभाइरस परिवारको nsp9 अनुक्रम (104 र 113 अवशेषहरू बीचको भिन्नता) (SI परिशिष्ट, चित्र) को एक बहु अनुक्रम पङ्क्तिबद्धता (MSA) प्रदर्शन गर्यौं। S6)।कुल मिलाएर, विभिन्न स्तनधारी प्राणी, चराचुरुङ्गी र सरीसृपलाई संक्रमित गर्ने अर्थोकोरोनाभिरिने उपपरिवारको ५ जेनेराका ४७ (ज्ञात र पुटेटिभ) प्रजातिहरूमा जम्मा ८ अवशेषहरू मात्र अपरिवर्तनीय पाइयो।सबैभन्दा व्यापक परिवर्तनहरू, मेटाउने र सम्मिलितहरू सहित, nsp9 को माध्यमिक संरचना तत्वहरू बीचको चक्रहरूमा अवलोकन गरिएको थियो, जुन अघिल्लो संरचनात्मक अध्ययनहरू (26 ??28) द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।nsp9 को C-टर्मिनल भागको β स्ट्र्यान्ड र α हेलिक्समा पाँच अपरिवर्तनीय अवशेषहरू भेटिए।तीन अपरिवर्तनीय अवशेषहरूले nsp9 को N टर्मिनसको NNE आकृति गठन गर्दछ।यो आकृतिको दोस्रो Asn एक मात्र अपरिवर्तनीय अवशेष हो, जुन टाढा सम्बन्धित भ्यागुता कोरोनाभाइरसको काल्पनिक nsp9 द्वारा साझा गरिएको छ, र Alphaletovirus को उपपरिवार Letovirinae मा Microhyla letovirus 1 प्रजातिको प्रतिनिधित्व गर्दछ।nsp9 माध्यमिक संरचना तत्वहरूमा अवशेषहरूको संरक्षणलाई फोल्डिंग वा ज्ञात आरएनए बाध्यकारी गुणहरू कायम राख्न संरचनात्मक विचारहरूद्वारा तर्कसंगत गर्न सकिन्छ।यद्यपि, यो तर्क NNE को संरक्षणमा लागू हुने देखिँदैन, र यो अध्ययन भन्दा पहिले, ट्रिपेप्टाइड अनुक्रमको भिन्नतालाई सीमित गर्ने बाधाहरूको प्रकृति पूर्ण रूपमा अस्पष्ट थियो।

कोरोनाभाइरस प्रतिकृतिमा nsp9-NMPylation र NNE संरक्षणको महत्त्व निर्धारण गर्न, हामीले HCoV-229E म्युटेन्टहरू उत्पादन गर्‍यौं, जसले nsp9 N-टर्मिनल अवशेषहरूको एकल वा दोहोरो प्रतिस्थापनहरू बोक्छ, जसले nsp9 NMPylation भिट्रोमा हानिकारक छ भनी संकेत गर्छ।हामीले सुरु गर्नु अघि, हामी यी प्रतिस्थापनहरूले (nsp8|9 क्लीभेज साइटको नजिक) सी-टर्मिनल pp1a क्षेत्रको प्रोटियोलाइटिक प्रशोधनलाई असर गर्छ कि गर्दैन भन्ने प्रश्नको जवाफ दिने प्रयास गर्छौं।nsp9 को N-टर्मिनसमा सम्बन्धित प्रतिस्थापनहरू समावेश गर्ने nsp7-11 पोलीप्रोटिन निर्माणहरूको सेट E. coli मा उत्पादन गरियो र पुन: संयोजक Mpro संग काटियो।Mpro-मध्यस्थता nsp8 वेबसाइट।

Huh-7 कोशिकाहरू nsp9 N टर्मिनसमा संरक्षित NNE tripeptides (N3825, N3826, र E3827) मा जीनोम-लम्बाइ HCoV-229E RNA, एन्कोडिङ Ala वा Ser प्रतिस्थापनहरूद्वारा ट्रान्सफेक्ट गरिएको थियो, धेरै जसो उत्परिवर्तनहरू घातक छन् भनेर देखाउँदै।हामीले N-टर्मिनल Asn (N2835A वा N2835S) को Ser वा Ala प्रतिस्थापन गरेर भाइरसलाई बचाउन सक्षम थियौं, तर NNE अनुक्रम (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) मा अन्य एकल र दोहोरो उत्परिवर्तनको साथ भाइरस पुन: प्राप्ति गर्न असफल भयौं। NN3825/6SS) , E3827A) (चित्र 5D)।

यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि टिस्यु कल्चरमा कोरोनाभाइरसको प्रतिकृति प्रतिबन्धित (उस्तै वा समान), शरीरमा nsp9 NMPylation साइटहरूको प्राकृतिक उत्परिवर्तनलाई सीमित गर्दै, र कोरोनाभाइरसको जीवन चक्रमा यस प्रतिक्रियाको मुख्य भूमिकालाई समर्थन गर्दछ।

प्रयोगहरूको अन्तिम सेटमा, हामीले C-terminal His6 लेबल गरिएको SARS-CoV-2 nsp12 र nsp9, र E. coli मा nsp12 को दुई उत्परिवर्ती रूपहरू उत्पादन गर्यौं।NiRAN र RdRp डोमेनहरूमा सक्रिय साइट अवशेषहरू क्रमशः Ala को सट्टा प्रयोग गर्नुहोस् (चित्र 6A र SI परिशिष्ट, तालिका S2)।SARS-CoV-2 nsp12 मा K4465 HCoV-229E (SI परिशिष्ट, चित्र S2) मा K4135 सँग मेल खान्छ, जुन NiRAN गतिविधि र HCoV-229E प्रतिकृति (चित्र 3D र E) को लागि आवश्यक साबित भयो।यो अवशेष धमनी भाइरस EAV nsp9 K94 अवशेषसँग पनि मेल खान्छ, जुन पहिले NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) को लागि आवश्यक देखाइएको थियो।चित्र 6B मा देखाइए अनुसार, SARS-CoV-2 nsp12 सँग nsp9 लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरी UMP ट्रान्सफरेज गतिविधि छ, जबकि nsp12_K4465A सक्रिय साइट म्युटेन्ट निष्क्रिय छ।RdRp motif C को SDD विशेषता अनुक्रममा दोहोरो प्रतिस्थापनले UMP ट्रान्सफरेज गतिविधि (चित्र 6B) लाई असर गर्दैन, RdRp गतिविधिको nsp9 UMPylation मा कुनै प्रत्यक्ष प्रभाव छैन भनेर संकेत गर्दछ।समान डेटा CTP, GTP र ATP (SI परिशिष्ट, चित्र S10) प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो।संक्षेपमा, यी डेटाले NiRAN-मध्यस्थता nsp9 NMPylation को अर्थोकोरोनाभाइरस उपपरिवारको विभिन्न जेनेरालाई प्रतिनिधित्व गर्ने कोरोनाभाइरसहरूमा रूढिवादी गतिविधि रहेको संकेत गर्छ।

SARS-CoV-2 nsp12- मध्यस्थ NMPylation of nsp9।(A) Coomassie स्टेन्ड SDS-polyacrylamide जेल NMPylation परीक्षणमा प्रयोग गरिएको पुनः संयोजक प्रोटीन देखाउँदै।नियन्त्रणको रूपमा, SARS-CoV-2 nsp12 को NiRAN डोमेन (K4465A) र RdRp डोमेन (DD5152/3AA) मा सक्रिय साइट प्रतिस्थापनको साथ एक उत्परिवर्ती प्रोटीन प्रयोग गरिएको थियो।अवशिष्ट संख्या pp1ab मा स्थिति मा आधारित छ।(B) nsp9-His6 र [α-32P]UTP को nsp12-His6 (जंगली प्रकार [wt] र उत्परिवर्ती) को सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरेर UMPylation पत्ता लगाउने Autoradiograph।लेबल गरिएको प्रोटीनको आणविक द्रव्यमान (किलोडाल्टनमा) बायाँमा देखाइएको छ।

NiRAN डोमेनहरू सामान्यतया Nidovirales (16) मा संरक्षित गरिन्छन्, यसले निडोभाइरस प्रतिकृतिको लागि आवश्यक इन्जाइम्याटिक प्रतिक्रियाहरूलाई उत्प्रेरित गर्छ भन्ने संकेत गर्दछ।यस अध्ययनमा, हामीले यो प्रमाणित गर्न सक्षम थियौं कि कोरोनाभाइरसको NiRAN डोमेनले NMP (NTP बाट उत्पन्न) nsp9 लाई स्थानान्तरण गर्दछ, भाइरस प्रतिकृति (26?? 29) मा संलग्न रहस्यमय RNA बाइन्डिङ प्रोटीन, यसलाई प्राकृतिक लक्ष्यको रूपमा निर्धारण गर्न र। कोरोनाभाइरस RTC को साझेदार।

NiRAN डोमेनले तीन अनुक्रम मोटिफहरू (AN, BN, र CN) साझा गर्दछ, जसमा धेरै सानो संख्यामा अवशेषहरू छन् जुन सबै परिवारहरूमा मोनोफिलेटिक तर उच्च भिन्नता Nidovirales क्रम (8, 16) मा संरक्षित छन्।भर्खरैका अध्ययनहरूले देखाएको छ कि तिनीहरू संरचनात्मक रूपमा प्रोटीन किनेज-जस्तो प्रोटीनहरूको ठूलो मात्रामा अपरिचित परिवारसँग सम्बन्धित छन्, जसलाई मूल रूपमा SelO परिवार भनिन्छ (17, 19, 22, 30, 31)।SelO-सम्बन्धित प्रोटीनहरूमा किनेज फोल्डहरू छन्, तर शास्त्रीय किनेसहरूमा धेरै संरक्षित सक्रिय साइट अवशेषहरू छैनन् (22, 32)।सक्रिय साइटमा बाँधिएको एटीपी अणुहरूको उल्टो अभिमुखीकरणको आधारमा र विशिष्ट अन्तरक्रियाहरूद्वारा स्थिर गरिएको, SelO को परिकल्पना गरिएको थियो र पछि AMP (फस्फेटको सट्टा) प्रोटीन सब्सट्रेटमा स्थानान्तरण गर्न पुष्टि गरियो (22), जबकि अर्को ब्याक्टेरिया SelO-जस्तो प्रोटीन YdiU छ। भर्खरै Tyr र विभिन्न प्रोटीन सब्सट्रेट (33) को उनको अवशेषहरूमा UMP को सहसंयोजक संलग्नक उत्प्रेरित गर्न देखाइएको छ।

कोरोनाभाइरस NiRAN डोमेनको पुटेटिभ सक्रिय साइट अवशेषहरूको भविष्यवाणी पुष्टि गर्न र विस्तार गर्न, हामीले कोरोनाभाइरस nsp12 (चित्र 3D र E र SI परिशिष्ट, चित्र S3 र तालिका) S1â मा उत्परिवर्तन विश्लेषण गर्न बायोकेमिकल र रिभर्स जेनेटिक्स विधिहरू प्रयोग गर्यौं। S4)।डाटाले देखाउँछ कि HCoV-229E K4135, R4178 र D4280 को Ala सँग प्रतिस्थापनले एनटीपी γ-फस्फेटमा उनीहरूको उपस्थितिलाई समर्थन गर्दै सेल संस्कृतिमा भिट्रो NMP ट्रान्सफरेज गतिविधि र भाइरस प्रतिकृति (चित्र 3D र E र SI परिशिष्टहरू, चित्र S3) लाई हटाउँछ। (K4135, R4178) र सक्रिय साइट धातु आयनहरूको समन्वय (D4280)।K4135 (17) स्थितिलाई स्थिर गर्ने भविष्यवाणी गरिएको चराको गुँड भाइरसको दायरामा संरक्षित ग्लुको E4145A प्रतिस्थापन भाइरल प्रतिकृति हटाउन देखाइएको थियो, तर आश्चर्यजनक रूपमा, गतिविधिलाई इन भिट्रो NMPylation परख (चित्र 3D र E) मा कायम राखिएको थियो। SI परिशिष्ट, चित्र S3 र तालिकाहरू S1-S4)।समान प्रतिस्थापन साल्मोनेला टाइफिमुरियम (E130A) (33) को YdiU homolog मा पेश गर्दा समान अवलोकन गरिएको थियो।सँगै लिइएको, यी डाटाहरूले उत्प्रेरक प्रकार्यको सट्टा यस संरक्षित अवशेषको नियामक कार्यलाई समर्थन गर्दछ।

HCoV-229E NiRAN डोमेन (8) मा नेस्टोभाइरसको दायरा भित्र संरक्षित Phe अवशेष (F4281A) प्रतिस्थापन गर्दा भिट्रोमा NMPylation गतिविधिमा कमी र सेल संस्कृतिमा भाइरस प्रतिकृतिमा उल्लेखनीय कमी भयो (चित्र 3D, E र SI) परिशिष्ट, चित्र S3)।डेटा यस अवशेषको महत्त्वपूर्ण नियामक कार्यसँग मिल्दोजुल्दो छ, जस्तै होमोलोगस DFG मोटिफ Phe अवशेषहरू पहिले देखाइएको।शास्त्रीय प्रोटीन किनेसहरूमा, यो Mg2+ बाइन्डिङ लूपको भाग हो र मेरुदण्डलाई जम्मा गर्न र विनियमित गर्न मद्दत गर्दछ???प्रभावकारी उत्प्रेरक गतिविधिको लागि आवश्यक (32, 34)।K4116 अवशेषहरूको लागि Ala र Arg को प्रतिस्थापन (preAN motif मा), क्रमशः, भाइरल प्रतिकृति हट्यो र, अपेक्षित रूपमा, एनएमपी ट्रान्सफरेज गतिविधिमा भिट्रोमा विभिन्न प्रभावहरू थिए, प्रस्तुत गरिएको एमिनो एसिड साइड चेनको आधारमा (चित्र 3D र E र SI परिशिष्टहरू। , चित्र S3)।कार्यात्मक डेटा संरचनात्मक जानकारी संग संगत छ, यो अवशेष ATP फास्फेट (17) संग एक अन्तरक्रिया स्थापित गरेको संकेत गर्दछ।अन्य नेस्टेड भाइरस परिवारहरूको NiRAN डोमेनमा, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 को स्थिति Lys, Arg वा His (8) द्वारा ओगटेको छ, यसले यो विशिष्ट अवशेषको कार्यात्मक प्रतिबन्धलाई आराम गरिएको संकेत गर्दछ।D4188A र D4283A को प्रतिस्थापनले एन्जाइम गतिविधिलाई हटाउँछ वा कडा रूपमा घटाउँछ र भाइरस प्रतिकृति हटाउँछ (चित्र 3)।यी दुई अवशेषहरू प्रायः (तर सबै होइन) नेस्टेड भाइरसहरू (8) मा संरक्षित छन्, एक महत्त्वपूर्ण परिवार-विशिष्ट तर सम्भवतः गैर-उत्प्रेरक कार्यलाई संकेत गर्दछ।धेरै अन्य Lys र Asp अवशेषहरू (K4113A, D4180A, D4197A र D4273A) को Ala प्रतिस्थापनहरू जुन Coronaviridae वा अन्य Nestioviridae परिवारहरूमा संरक्षित छैनन् (8) नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरियो।अपेक्षित रूपमा, यी प्रतिस्थापनहरू धेरै हदसम्म सहन योग्य छन्, एन्जाइम गतिविधि र केही अवस्थाहरूमा भाइरल प्रतिकृतिमा थोरै कमीको साथ (चित्र 3 र SI परिशिष्ट, चित्र S3)।समग्रमा, कोरोनाभाइरस mutagenesis डाटा EAV NiRAN-RdRp (16) को सेल्फ-जीएमपी र रिभर्स आनुवंशिकी डेटासँग धेरै एकरूप छ, जसमा EAV nsp9 (कोरोनाभाइरस nsp12 ortholog) अवशेष K94 (HCoV- 229E K4135 सँग सम्बन्धित), महत्त्वपूर्ण कार्यहरू। R124 (R4178 सँग सम्बन्धित), D132 (D4188 सँग सम्बन्धित), D165 (D4280 सँग सम्बन्धित), F166 (F4281 सँग सम्बन्धित)।थप रूपमा, HCoV-229E mutagenesis डेटा पहिले रिपोर्ट गरिएको SARS-CoV रिभर्स आनुवंशिकी डेटा (16) सँग अनुरूप र विस्तार गरिएको छ, जसरी सम्बन्धित CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 को लागि अवलोकन गरिएको जस्तै समान छ। वर्णन गरिएको फेनोटाइप -F219A र HCoV-229E_F4281A (चित्र 3 D र E र SI परिशिष्ट, चित्र S3 र तालिका S1-S4)।

EAV orthologs (16), जसमा UTP र GTP (सेल्फ-NMPylation प्रतिक्रियामा) को लागि स्पष्ट प्राथमिकता छ, को तुलनामा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि कोरोनाभाइरस NiRAN डोमेन (HCoV-229E र SARS-CoV-2 द्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको) प्रभावकारी रूपमा हुन सक्छ। सबै चार NMP हरू स्थानान्तरण गरियो, यद्यपि UMP को लागि थोरै प्राथमिकता छ (चित्र 1 र 3)।विशिष्ट NTP सह-सब्सट्रेटको तुलनात्मक रूपमा कम विशिष्टता हालसालै रिपोर्ट गरिएको SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपरकम्पोजिट संरचनासँग मिल्दोजुल्दो छ, जसमा ADP-Mg2+ NiRAN को सक्रिय साइटसँग जोडिएको छ, तर एडिनाइन पार्टसँग होइन। विशिष्ट अन्तरक्रियाको गठन (17)।हाम्रो अध्ययनमा, NMPylation प्रतिक्रियामा प्रयोग गरिएको न्यूक्लियोटाइडको प्रकारले उत्परिवर्ती प्रोटीन (SI परिशिष्ट, चित्र S3) को गतिविधिमा कुनै भिन्न प्रभाव पार्दैन, संकेत गर्दछ कि यी अवशेषहरू मध्ये कुनै पनि विशिष्ट न्यूक्लियोबेसको बन्धनसँग नजिकबाट सम्बन्धित छैन।कोरोनाभाइरस र धमनी भाइरसहरूको NiRAN डोमेनहरूमा अवलोकन गरिएका विभिन्न NTP सह-सब्सट्रेट प्राथमिकताहरूको संरचनात्मक आधार र सम्भावित जैविक महत्त्व अध्ययन गर्न बाँकी छ;तिनीहरू सत्य हुन सक्छन् वा तिनीहरूको सम्बन्धित अध्ययनको सीमितताको कारण हुन सक्छ।हाल, यो नकार्न सकिँदैन कि धमनी भाइरस NiRAN डोमेनको सम्भावित NMPylator गतिविधि (पहिले वर्णित स्व-NMPylation गतिविधिको तुलनामा) फरक सह-सब्सट्रेट प्राथमिकता छ, ध्यानमा राख्दै धमनी र कोरोनाभाइरस बीच समानता। NiRAN डोमेन यसको सीमामा छ।अनुक्रम-आधारित तुलना (१६)।स्यूडोकिनेस सेलओसँग तुलना गर्दा, जसले Mg2+ कोफ्याक्टरको रूपमा प्रयोग गर्दछ, कोरोनाभाइरस र धमनी भाइरस NiRAN को गतिविधि Mn2+ (16) (चित्र 3C र SI परिशिष्ट, चित्र S1) मा निर्भर छ।Mn2+ निर्भरता र UTP को लागि स्पष्ट प्राथमिकता प्रोटीन NMPylators को एक असामान्य विशेषता हो, र भर्खरै साल्मोनेला टाइफिमुरियमको YdiU प्रोटीनमा पुष्टि भएको छ, जसले कोशिकाहरूलाई तनाव प्रेरण सेल एटीपी पूलबाट जोगाउन कडा Mn2+-निर्भर प्रोटीन चेपेरोन UMPylation लाई उत्प्रेरित गर्दछ। ३३)।

कोरोनाभाइरस NiRAN डोमेन र सेलुलर प्रोटीन किनेसेस (17, 19) बीच भर्खरै वर्णन गरिएको संरचनात्मक समानताले NMP लाई हामीले यस अध्ययनमा रिपोर्ट गरेका अन्य प्रोटीनहरूसँग सहसंयोजक रूपमा लिङ्क गर्ने NiRAN को क्षमताको लागि थप समर्थन प्रदान गर्दछ।हामीले HCoV-229E ORF1a द्वारा इन्कोड गरिएका प्रोटिनहरूमा सम्भावित NiRAN लक्ष्यहरूको खोजीमा केन्द्रित थियौं, जुन प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा RTC को ORF1b-इन्कोडेड प्रतिकृति (१२, ३५) लाई सहयोग गर्न जानिन्छ।हाम्रो प्रयोगहरूले nsp9 को प्रभावकारी र विशिष्ट NMPylation को लागि निर्णायक प्रमाण प्रदान गर्दछ (चित्र 2)।यदि लक्ष्य प्रोटीन मोलर अतिरिक्तमा प्रयोग गरिन्छ जुन इन्जाइम (nsp12) भन्दा 8 देखि 10 गुणा बढी हुन्छ, यो पुष्टि हुन्छ कि nsp9 पूर्ण रूपमा (मोनो) NMPized छ (चित्र 4)।हामीले निष्कर्ष निकाल्यौं कि nsp12 र nsp9 बीचको अन्तरक्रिया अल्पकालीन हुन्छ र यसले nsp9 (अन्य RTC सबयुनिटहरूको अनुपस्थितिमा) सँग स्थिर जटिल बनाउँदैन।यो निष्कर्ष SARS-CoV प्रोटोम (35) मा प्रोटीन अन्तरक्रिया अध्ययन द्वारा समर्थित छ।MS विश्लेषणले nsp9 को N-टर्मिनल अवशेषको प्राथमिक amine लाई NMPylation साइट (SI परिशिष्ट, चित्र S5) को रूपमा पहिचान गर्‍यो।फस्फोरामिडेट बन्ड र एन-टर्मिनल एमिनो समूहको गठनले NiRAN-मध्यस्थता NMPylation गतिविधिलाई स्यूडोमोनास सिरिङ्गे SelO-मध्यस्थता एएमपिलेसन प्रतिक्रियाबाट छुट्याउँछ, जसले Ser, Thr, वा Tyr अवशेषहरूमा O-linked AMP को गठनलाई उत्प्रेरित गर्दछ। 22), र S. typhimurium YdiU ले O-linked (Tyr संग) र N-linked (उनको साथ) पेप्टाइड-UMP एडक्ट्स बनाउँछ।प्रोटिनहरूको SelO परिवारमा उपलब्ध सीमित जानकारीले यो ठूलो प्रोटीन परिवारका सदस्यहरू पेप्टाइड-NMP एडक्ट्सको गठनमा धेरै भिन्नता रहेको संकेत गर्छ।यो एक रोचक अवलोकन हो जुन थप अध्ययनको योग्य छ।

यस अध्ययनमा प्राप्त डाटाले हामीलाई Nsp9 को NMPylation लाई नि:शुल्क N-टर्मिनस चाहिन्छ भनेर परिकल्पना गर्न नेतृत्व गर्यो।भाइरल प्रतिकृतिको सन्दर्भमा, यो Mpro र pp1ab द्वारा मध्यस्थता गरिएको replicase polyprotein pp1a मा nsp8|nsp9 प्रशोधन साइटको प्रोटियोलाइटिक क्लीभेज द्वारा प्रदान गरिनेछ।धेरैजसो कोरोनाभाइरसहरूमा, यो विशिष्ट साइट (VKLQ|NNEI HCoV-229E मा) र अन्य सबै कोरोनाभाइरस Mpro क्लीभेज साइटहरू बीचको भिन्नता Asn (अला, Ser वा Gly जस्ता अन्य सानो अवशेषहरू भन्दा) P1â ओगटेको छ???स्थान (36)।प्रारम्भिक अध्ययनहरूमा प्राप्त पेप्टाइड क्लीभेज डेटाले देखायो कि एनएसपी8 pp1a क्षेत्र, वा 2) भाइरस प्रतिकृतिमा विशेष संरक्षित nsp9 N-टर्मिनसको भूमिका (37)।हाम्रो डाटा (चित्र 5A) ले वास्तविक N-टर्मिनल अनुक्रम बोक्ने nsp9 को पुन: संयोजक रूपलाई nsp12 द्वारा प्रभावकारी रूपमा NMPized गरिएको थियो।N-टर्मिनल फ्ल्याङ्किङ अनुक्रम कारक Xa (nsp9-His6; SI परिशिष्ट, तालिका S1) वा Mpro-मध्यस्थ क्लीभेज (nsp7-11-His6; चित्र 5A र SI परिशिष्ट, तालिका S1) द्वारा हटाइयो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, uncut nsp9- युक्त पूर्ववर्ती nsp7-11-His6 ले nsp12 को NMPylation को प्रतिरोध देखायो, जुन हाम्रो डेटासँग मिल्दोजुल्दो छ, संकेत गर्दछ कि nsp9-NMP एडक्ट N-टर्मिनल प्राथमिक amine (SI परिशिष्ट, चित्र S5) मार्फत गठन भएको छ। ।NiRAN सब्सट्रेट विशिष्टताको गहिरो समझ प्राप्त गर्न, हामीले त्यसपछि nsp9 को छेउछाउको N-टर्मिनल अवशेषहरूमा ध्यान केन्द्रित गर्यौं।अन्य प्रोटीनहरूको अनुपस्थितिमा, तिनीहरू संरचनात्मक रूपमा लचिलो हुन्छन्, तिनीहरूलाई nsp9 (26 28, 38) को लेबल नगरिएको रूपमा पत्ता लगाउनबाट रोक्छ, तिनीहरूको सीमित प्राकृतिक भिन्नतालाई संकेत गर्दछ यो महत्त्वपूर्ण अनुक्रम-विशिष्ट (सेकेन्डरी संरचना सम्बन्धित छैन) को कारणले हो। nsp9 N-टर्मिनल खण्डको कार्य।यस क्षेत्रमा संरक्षित अवशेषहरूको अला प्रतिस्थापन (चित्र 5C र D र SI परिशिष्ट, चित्र S8) ले बताउँछ कि N3826 भिट्रोमा nsp9 NMPylation को लागि आवश्यक छ, जबकि N3825A र E3827A प्रतिस्थापनले NMPylation मा कमी ल्याउनेछ, जबकि P3380 substitutions र P3380 ले गर्दैन। ।स्पष्ट रूपमा nsp9 NMPylation लाई असर गर्छ।यद्यपि N-टर्मिनल Asn (N3825A, N3825S) को प्रतिस्थापनले nsp9 NMPylation र सेल संस्कृति (चित्र 5C र D) मा भाइरस प्रतिकृतिमा मात्र मध्यम प्रभाव पारेको छ, N-टर्मिनल 3825-NN dipe बाट Asn अवशेष अनुक्रम मेटाउने। यो भाइरसहरूको लागि घातक हो भनेर प्रमाणित हुन्छ, यसले संकेत गर्दछ कि एन-टर्मिनसमा अर्को अवशेषको अगाडि एक Asn अवशेष आवश्यक छ, अधिमानतः Asn, यद्यपि यस्तो देखिन्छ कि समान अवशेषहरूको प्रतिस्थापन आंशिक रूपमा सहन सकिन्छ (चित्र 5B, C, र D)।हामी निष्कर्षमा पुग्छौं कि 3825-NN dipeptide, विशेष गरी कोरोनाभाइरस दायरा (SI परिशिष्ट, चित्र S6) भित्र संरक्षित र आवश्यक N3826 अवशेषले NiRAN को सक्रिय साइटमा nsp9 N-टर्मिनसको सही बाइन्डिङ र अभिमुखीकरण सुनिश्चित गर्दछ।

Ala (E3827A) को प्रतिस्थापन सबै उपपरिवारहरूको संरक्षित ग्लुको लागि भिट्रोमा nsp9 NMPylation कायम राख्छ तर सेल संस्कृति (चित्र 5C र D) मा भाइरसहरूको लागि घातक हुन्छ, यो अवशेषको अतिरिक्त कार्यलाई संकेत गर्दछ, उदाहरणका लागि, मुख्य अन्तरक्रियाहरूमा (NMPylated वा अपरिवर्तित। ) nsp9 N-टर्मिनस र भाइरस प्रतिकृतिमा संलग्न अन्य कारकहरू।Nsp9 उत्परिवर्तनहरूले nsp9 को प्रोटियोलाइटिक प्रक्रिया वा कुनै पनि छेउछाउको nsps (39) (SI परिशिष्ट, चित्र S9) लाई असर गर्दैन, देखाइएको धेरै nsp9 उत्परिवर्तनहरूको घातक फेनोटाइपहरू C प्रोटियोलाइटिक प्रक्रिया-टर्मिनल pp1a क्षेत्रको dysregulation को कारणले भएको थिएन भनेर संकेत गर्दछ। ।

माथिको डेटाले प्रमाण प्रदान गर्दछ कि pp1a/pp1ab मा nsp8थप रूपमा, nsp9 को N-टर्मिनसको उत्कृष्ट संरक्षण (कोरोनाभाइरस परिवारमा एकल र अपरिवर्तनीय Asn अवशेषहरू सहित) र यस अध्ययनमा प्राप्त उल्टो आनुवंशिकी डेटा (चित्र 3E र 5D) ले हामीलाई वर्णन गरिएको nsp9 NMPylation को निष्कर्षमा पुर्‍यायो। जैविक रूपमा सम्बन्धित छ र कोरोनाभाइरस प्रतिकृतिको लागि आवश्यक छ।यस परिमार्जनको कार्यात्मक नतिजाहरू अध्ययन गर्न बाँकी छन्, उदाहरणका लागि, पहिले वर्णन गरिएको (गैर-विशिष्ट) nsp9 (अपरिसोधित फारम) RNA बाध्यकारी गतिविधि (2628) को सन्दर्भमा।एन-टर्मिनल NMPylation ले प्रोटीन वा आरएनए सब्सट्रेटहरूसँग nsp9 को अन्तरक्रिया वा विभिन्न चार-स्तर असेंबलीहरूको गठनलाई पनि असर गर्न सक्छ।यी संरचनात्मक अध्ययनहरूमा अवलोकन गरिएको छ र कोरोनाभाइरस प्रतिकृतिसँग कार्यात्मक रूपमा सम्बन्धित भएको पुष्टि गरिएको छ, यद्यपि विशेष गरी यो परिमार्जनको अवस्थामा (26- ââ29, 40) को अनुपस्थितिमा।

यद्यपि कोरोनाभाइरस NiRAN डोमेनको लक्ष्य विशिष्टता अझै विस्तृत रूपमा वर्णन गर्न आवश्यक छ, हाम्रो डाटाले देखाउँदछ कि कोरोनाभाइरस NiRAN डोमेनको प्रोटीन लक्ष्य विशिष्टता धेरै साँघुरो छ।यद्यपि सबै निडोभाइरस परिवारहरूको NiRAN डोमेनमा प्रमुख सक्रिय साइट अवशेषहरू (8, 16) को संरक्षणले यी प्रोटीनहरू संरक्षित NMPylator को गतिविधिलाई दृढतापूर्वक समर्थन गर्दछ, यस डोमेनको सब्सट्रेट बाइन्डिंग पकेट अवशेषहरूको पहिचान संरक्षण र संरक्षणको विशेषता हुन बाँकी छ। , र Nidovirales उद्देश्यका विभिन्न परिवारहरू बीच फरक हुन सक्छ।त्यसैगरी, अन्य नेस्टेड भाइरसहरूको सान्दर्भिक लक्ष्यहरू निर्धारण गर्न बाँकी छ।तिनीहरू nsp9 वा अन्य प्रोटीनहरूको रिमोट अर्थोलगहरू हुन सक्छन्, किनभने सामान्यतया नेस्टेड भाइरसहरूमा संरक्षित गरिएका पाँच प्रतिकृति डोमेनहरू बाहिरका अनुक्रमहरू कम संरक्षित हुन्छन् (8), Mpro र NiRAN बीचको जीनोम एरे सहित, तिनीहरूमध्ये, nsp9 मा अवस्थित छ। कोरोना भाइरस।

थप रूपमा, हामी हाल NiRAN डोमेनमा थप (सेलुलर सहित) लक्ष्यहरू छन् भन्ने सम्भावनालाई अस्वीकार गर्न सक्दैनौं।यस अवस्थामा, यो उल्लेखनीय छ कि यो उभरिरहेको प्रोटीन NMPylators (NMPylators) (30, 31) मा ब्याक्टेरियल होमोलोगहरू "मास्टर रेगुलेटरहरू" छन् जस्तो देखिन्छ?NMP ले तिनीहरूको डाउनस्ट्रीम गतिविधिहरू विनियमित गर्न वा हटाउन विभिन्न प्रकारका सेलुलर प्रोटीनहरू परिमार्जन गर्दछ, यसैले विभिन्न जैविक प्रक्रियाहरूमा भूमिका खेल्छ, जस्तै सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया र रेडक्स होमियोस्टेसिस (22, 33)।

यस अध्ययनमा (चित्र 2 र 4 र SI परिशिष्ट, चित्रहरू S3 र S5), हामीले प्रमाणित गर्न सक्षम थियौं कि nsp12 ले UMP (NMP) भागलाई nsp9 मा एकल (संरक्षित) स्थितिमा स्थानान्तरण गर्‍यो, जबकि अन्य प्रोटीनहरू परिमार्जन गरिएको थिएन। सर्तहरू अन्तर्गत प्रयोग गरिन्छ, राम्रोसँग परिभाषित (खुलाएको भन्दा) सब्सट्रेट विशिष्टता समर्थित छ।यो संग संगत, N-टर्मिनल nsp9 NMPylation को तुलनामा, nsp12 को आफ्नै NMPylation गतिविधि धेरै कम छ, यसको पत्ता लगाउन लामो autoradiography एक्सपोजर समय चाहिन्छ, र nsp12 एकाग्रता मा 10-गुना वृद्धि प्रयोग गरिन्छ।थप रूपमा, हाम्रो MS विश्लेषण nsp12 को NMPylation को लागि प्रमाण प्रदान गर्न असफल भयो, जसले NiRAN डोमेन स्व-NMPylation (उत्तम) माध्यमिक गतिविधि हो भनेर सुझाव दिन्छ।यद्यपि, यो ध्यान दिनुपर्छ कि अन्य अध्ययनहरूले प्रारम्भिक प्रमाण प्रदान गरेको छ कि ब्याक्टेरिया NMPylator को स्व-AMPylation स्थिति अन्य प्रोटीन सब्सट्रेटहरूमा NMPylation गतिविधि नियन्त्रण गर्न सक्छ (22, 33)।तसर्थ, EAV nsp9 (16) र कोरोनाभाइरस nsp12 (यस अध्ययन) को लागि रिपोर्ट गरिएको स्व-NMPylation गतिविधिहरूको सम्भावित कार्यात्मक प्रभावहरूको अनुसन्धान गर्न थप अनुसन्धान आवश्यक छ, C-टर्मिनल RdRp डोमेनको फोल्डिंगमा प्रस्तावित चेपेरोन-जस्तो प्रभाव सहित (। १६))

पहिले, nidoviral NiRAN डोमेनको सम्भावित डाउनस्ट्रीम प्रकार्यहरू सम्बन्धी धेरै परिकल्पनाहरू विचार गरियो, जसमा RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase र प्रोटीन प्राइमिङ गतिविधि (16), तर तिनीहरूमध्ये कुनै पनि उपलब्ध डाउनस्ट्रीम प्रकार्यहरूसँग उपयुक्त छैनन्।निम्न स्थानहरूमा प्राप्त जानकारीहरू अतिरिक्त अनुमानहरू नगरीकन ठ्याक्कै उही समय हो।यस अध्ययनमा प्राप्त डाटा NiRAN डोमेन प्रोटीन-प्रेरित आरएनए संश्लेषणको प्रारम्भमा संलग्न छ भन्ने कुरासँग धेरै संगत छ (तर प्रमाणित गर्न सक्दैन)।यो पहिले विश्वास थियो कि निरान डोमेन को कार्य 5 मा?²-RNA क्यापिङ वा RNA ligation प्रतिक्रियाहरू यी र अन्य डेटाको समर्थनबाट प्रभावित हुँदैन।तसर्थ, उदाहरणका लागि, NiRAN को सक्रिय साइटलाई सामान्य आधारको रूपमा संरक्षित Asp समावेश गरिएको मानिन्छ (Pseudomonas syringae SelO मा D252; HCoV-229E pp1ab मा D4271; SARS-CoV-2 nsp12 मा D208) (SI परिशिष्ट, चित्र 2) )।S2) (17, 22, 33), जबकि ATP-निर्भर RNA ligase र RNA क्यापिङ इन्जाइममा उत्प्रेरक कोभ्यालेन्ट इन्जाइम-(lysyl-N)-NMP मध्यवर्ती द्वारा गरिन्छ, जसमा गैर-परिवर्तन गरिएको Lys अवशेषहरू समावेश हुन्छन्। ४१)।थप रूपमा, संरक्षित प्रोटीन लक्ष्यहरूको लागि कोरोनाभाइरस NiRAN को उल्लेखनीय अनुक्रम-आधारित विशिष्टता र NTP सह-सब्सट्रेटहरू (UTP मनपर्छ) को लागि आराम विशिष्टताले NiRAN- मध्यस्थ क्यापिंग इन्जाइम वा RNA ligase-जस्तो प्रकार्यहरूको विरोध गर्दछ।

जाहिर छ, प्रमाणीकरण गर्न धेरै अतिरिक्त काम आवश्यक छ र, यदि प्रमाणित भयो भने, प्रोटीन-प्रेरित आरएनए संश्लेषणमा nsp9-UMP (nsp9-NMP) को सम्भावित भूमिकाको बारेमा विस्तृत गर्नुहोस्, जसले धेरै रोचक तर (अहिलेसम्म) पहिले रिपोर्ट गरिएका रिपोर्टहरू जडान गर्नेछ। ।पृथक अवलोकनहरू।उदाहरणका लागि, यो निर्धारण गरिएको छ कि कोरोनाभाइरसको नकारात्मक-स्ट्र्यान्ड आरएनएको अन्त्य ओलिगो(यू) स्ट्र्यान्ड (४२, ४३) बाट सुरु हुन्छ।यो अवलोकन नकारात्मक-स्ट्र्यान्ड RNA को संश्लेषण Nsp9 को UMPylated फारमलाई Poly(A) टेल (ट्रिगरहरू) मा बाँध्न प्रारम्भ गरिएको विचारसँग मेल खान्छ, जुन यसको RNA बाइन्डिङद्वारा प्रवर्द्धन गर्न सकिन्छ गतिविधि र/वा अन्तरक्रियासँग। अर्को RTC प्रोटीन।nsp9 द्वारा प्रदान गरिएको UMP भागलाई nsp7/8/nsp12-मध्यस्थ ओलिगोरिडिलेसनको लागि "प्राइमर" को रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ, जीनोमिक आरएनएमा 3??²-पोली(A) पुच्छर वा अर्को ओलिगो (A) भएको अनुक्रम प्रयोग गरेर। पिकोर्नाभाइरस VPg प्रोटीन (44) को लागि स्थापित मेकानिजम जस्तै टेम्प्लेटको रूपमा कार्य गर्दछ।के हुन्छ यदि प्रस्ताव "गैर मानक" हो????(प्रोटिन-प्रेरित) नकारात्मक-स्ट्र्यान्ड आरएनए संश्लेषणको प्रारम्भले अवलोकनहरूको लिङ्क प्रदान गर्दछ, यसले संकेत गर्दछ कि कोरोनाभाइरस नकारात्मक-स्ट्र्यान्ड आरएनएको अन्त्यमा UMP (UTP को सट्टा) छ (42), जुन संकेत गर्न मानिन्छ। न्यूक्लिक एसिड डाइसरले अज्ञात युरिडिन-विशिष्ट एन्डोन्यूक्लिज द्वारा अन्तिम फास्फोरिलेटेड क्लीभ गर्दछ।यदि पुष्टि भयो भने, यो न्यूक्लिक एसिड हाइड्रोलाइटिक गतिविधिले नवजात नकारात्मक स्ट्र्यान्डको 5 ² छेउबाट nsp9 को ओलिगोमेरिक UMPylated फारम जारी गर्न मद्दत गर्न सक्छ।प्रोटिन प्राइमिङमा nsp9 को सम्भावित भूमिका अघिल्लो उल्टो आनुवंशिकी अध्ययनहरूसँग पनि मिल्दोजुल्दो छ, जसले देखाएको छ कि nsp9 (र nsp8) ले आलोचनात्मक र विशेष गरी संरक्षित cis-अभिनय RNA तत्वसँग कोरोनाभाइरस जीनोमको 3 छेउमा अन्तरक्रिया गर्छ।४५)।यस प्रतिवेदनका अनुसार यी विगतका अवलोकनहरूलाई अब पुन: परीक्षण गरी थप अनुसन्धान मार्फत विस्तार गर्न सकिन्छ।

संक्षेपमा, हाम्रो डेटाले एन-टर्मिनसमा RdRp सँग लिङ्क गरिएको स्वामित्व नेस्टेड भाइरस इन्जाइम ट्यागको विशिष्ट गतिविधि निर्धारण गर्‍यो।कोरोनाभाइरसमा, यो भर्खरै पत्ता लागेको NiRAN- मध्यस्थ UMPylator/NMPylator गतिविधि Mn2+ र नजिकैको Asn अवशेषहरूमा भर पर्न र N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनको साथ (कम-ऊर्जा) फस्फोरामिडेट बन्धनको गठन गर्न प्रयोग गरिन्छ।एनएसपी8nsp12 NiRAN सक्रिय साइट र nsp9 लक्ष्यमा मुख्य अवशेषहरूको संरक्षण, SARS-CoV-2 सहित दुई कोरोनाभाइरसहरूबाट प्राप्त डाटासँग मिलेर, nsp9 NMPylation एक कोरोनाभाइरस हो भन्ने कुराको बलियो प्रमाण प्रदान गर्दछ कन्जरभेटिभ सुविधाहरू पनि भाइरस प्रतिकृतिमा एक प्रमुख चरण हो।उपलब्ध डाटाले हामीलाई प्रोटिन-प्रेरित आरएनए संश्लेषणमा एनएसपी9 को एनएमपीलेटेड फारमको विशिष्ट भूमिका कोरोनाभाइरस र अन्य नेस्टेड भाइरसहरूको लागि एक उचित परिदृश्य हो भन्ने निष्कर्षमा पुर्‍याउँछ, र NiRAN ले अन्य अज्ञात प्रोटीनहरूलाई पनि लक्षित गर्न सक्छ।भाइरस नियमन गर्नुहोस्।होस्ट अन्तरक्रिया।यदि पुष्टि भयो भने, भाइरल RNA संश्लेषणमा प्रोटीन प्राइमरहरूको संलग्नताले Mpro/3CLpro र RdRp डोमेनहरूको अनुक्रम सम्बन्धलाई पहिले नै पत्ता लगाएको कोरोनाभाइरस र picornavirus-जस्तो सुपरसमूह (9) को बीचमा बढाउनेछ, जुन हालै स्थापित Pisonivirites (9) मा एकीकृत भएको छ। 46) वर्गमा।

हाम्रो डेटाले यो पनि देखाउँछ कि यस अध्ययनमा पहिचान गरिएको आधारभूत, छनौट र रूढ़िवादी इन्जाइम गतिविधिहरू एन्टिभाइरल औषधिहरूको लागि लक्ष्यको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।NiRAN को सक्रिय साइटमा संरक्षित nsp9 N-टर्मिनसको बाध्यकारी (र त्यसपछिको परिमार्जन) मा हस्तक्षेप गर्ने यौगिकहरूलाई प्रभावकारी र बहुमुखी एन्टिभाइरल औषधिमा विकास गर्न सकिन्छ, विभिन्न (उप) जीनस संक्रमणहरूबाट जनावर र मानव कोरोनाभाइरसको उपचारको लागि उपयुक्त। SARS-CoV-2 र मध्य पूर्व रेस्पिरेटरी सिन्ड्रोम कोरोनाभाइरस सहित।

यस अध्ययनमा उत्पादित कोरोनाभाइरस प्रोटीनको कोडिङ अनुक्रम RT-PCR द्वारा HCoV-229E बाट संक्रमित Huh-7 बाट पृथक गरिएको वा SARS-CoV-2 बाट संक्रमित भेरो E6 प्रयोग गरी RT-PCR द्वारा विस्तार गरिएको थियो, र मानक क्लोनिङ प्रक्रियाहरू प्रयोग गरी सम्मिलित गरिएको थियो।pMAL-c2 (न्यू इङ्गल्याण्ड जैविक प्रयोगशाला) वा PASK3-Ub-CHis6 (47) अभिव्यक्ति भेक्टर (SI परिशिष्ट, तालिकाहरू S1 र S2)।एकल कोडोन प्रतिस्थापन PCR-आधारित साइट-निर्देशित mutagenesis (48) द्वारा प्रस्तुत गरिएको थियो।MBP फ्युजन प्रोटीन उत्पादन गर्न, E. कोलाई TB1 कोशिकाहरू उपयुक्त pMAL-c2 प्लाज्मिड निर्माण (SI परिशिष्ट, तालिका S1) संग रूपान्तरण गरियो।फ्युजन प्रोटीनलाई एमाइलोज एफिनिटी क्रोमेटोग्राफीद्वारा शुद्ध गरिएको थियो र कारक Xa संग क्लीभ गरिएको थियो।पछि, C-टर्मिनल His6-ट्याग गरिएको प्रोटीन Ni-immobilized मेटल एफिनिटी क्रोमेटोग्राफी (Ni-IMAC) द्वारा पहिले वर्णन गरिए अनुसार शुद्ध गरिएको थियो (49)।ubiquitin फ्युजन प्रोटीन उत्पादन गर्न, E. coli TB1 कोशिकाहरूले उपयुक्त paSK3-Ub-CHis6 प्लाज्मिड निर्माण (SI परिशिष्ट, तालिकाहरू S1 र S2) र pCGI प्लाज्मिड DNA एन्कोडिङ ubiquitin-विशिष्ट C-टर्मिनल हाइड्रोलेज 1 (Ubp1) प्रयोग गरे।रूपान्तरण (४७)।C-टर्मिनल His6-ट्याग गरिएको कोरोनाभाइरस प्रोटीन पहिले वर्णन गरिए अनुसार शुद्ध गरिएको थियो (50)।

HCoV-229E nsp12-His6 को स्व-NMPylation परीक्षण EAV nsp9 (16) मा वर्णन गरिए अनुसार गरिएको थियो।छोटकरीमा, nsp12-His6 (0.5 µM) मा 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer, 25mm समावेश छ। निर्दिष्ट NTP र 0.17 µM मिलेको [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C मा 30 मिनेटको लागि।nsp12-मध्यस्थता nsp9 NMPylation को अन्य सबै (मानक) NMPylation assays मा, प्रतिक्रिया अवस्थाहरू निम्नानुसार समायोजित हुन्छन्: nsp12-His6 (0.05 µM) र nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) को उपस्थितिमा। ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM सङ्केत NTP, र 0.17 µM मिलेको [α32-P]NTP।30 डिग्री सेल्सियसमा 10 मिनेटको लागि इन्क्युबेशन पछि, प्रतिक्रिया नमूना SDS-PAGE नमूना बफर: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% ग्लिसरोल र 0.005% 0.0005% मा मिसाइएको थियो। नीलो।प्रोटिनलाई 90 डिग्री सेल्सियसमा 5 मिनेटको लागि तताएर र 12% SDS-PAGE द्वारा अलग गरिएको थियो।जेल फिक्स गरिएको छ र Coomassie Brilliant Blue Solution (40% methanol, 10% एसिटिक एसिड, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), रङ लगाइएको छ, र 20 घण्टाको लागि फोस्फोरेसेन्ट इमेजिङ स्क्रिनमा खुला छ (NMPy बाट nsp12 पत्ता लगाउन)। वा (अधिकतम) २ घण्टा (nsp9 NMPylation को मूल्याङ्कन गर्न)।स्क्रिन स्क्यान गर्न टाइफुन ९२०० इमेजर (जीई हेल्थकेयर) प्रयोग गरिएको थियो र सिग्नलको तीव्रता विश्लेषण गर्न इमेजजे प्रयोग गरिएको थियो।

MS विश्लेषणको लागि, 1 µM nsp12-His6 र 10 µM nsp9 (हेक्साहिस्टिडाइन ट्याग बिना) NMPylation विश्लेषण (SI परिशिष्ट, तालिका S1) मा प्रयोग गरिएको थियो र 500 µM UTP र GTP को बढेको एकाग्रता प्रयोग गरिएको थियो।तिनीहरूको एकाग्रता र अपेक्षित प्रोटिनको गुणस्तरमा निर्भर गर्दै, MassPrep स्तम्भ (वाटरहरू) ले सुसज्जित वाटर्स ACQUITY H-Class HPLC प्रणाली 1 देखि 10 μL सम्मको बफर प्रोटीन समाधानहरू अनलाइन डिसल्ट गर्न प्रयोग गरिएको थियो।डिसल्ट गरिएको प्रोटिनलाई Synapt G2Si मास स्पेक्ट्रोमिटर (पानी) को इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोतमा बफर A (पानी/0.05% फॉर्मिक एसिड) र बफर B (एसिटोनिट्रिल/0.045% फॉर्मिक एसिड) को निम्न ढाँचा मार्फत निकालिन्छ, र स्तम्भको तापक्रम छ। 60 ° C र 0.1 mL/min को प्रवाह दर: 2 मिनेटको लागि 5% A संग इल्युसन isocratically, त्यसपछि 8 मिनेट भित्र 95% B मा रेखीय ग्रेडियन्ट, र अर्को 4 मिनेटको लागि 95% B कायम राख्नुहोस्।

500 देखि 5000 m/z को मास दायराको साथ सकारात्मक आयनहरू पत्ता लगाइन्छ।Glu-fibrinopeptide B स्वचालित मास ड्रिफ्ट सुधारको लागि प्रत्येक 45 सेकेन्डमा मापन गरिन्छ।बेसलाइन र स्मूथिङ घटाएपछि औसत स्पेक्ट्रमलाई डिकन्भल गर्न MaxEnt1 एक्सटेन्सनको साथ MassLynx इन्स्ट्रुमेन्ट सफ्टवेयर प्रयोग गर्नुहोस्।

UMPylated HCoV-229E nsp9 लाई सिक्वेन्सिङ-ग्रेड परिमार्जित ट्रिप्सिन (सर्वा) थपेर पचाइएको थियो र रातभर ३७ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड गरियो।एक Chromabond C18WP स्पिन स्तम्भ (भाग नम्बर 730522; माचेरी-नागेल) पेप्टाइडहरू डिसल्ट र केन्द्रित गर्न प्रयोग गरिएको थियो।अन्तमा, पेप्टाइड 25 μL पानीमा घुलियो, जसमा 5% एसिटोनिट्रिल र 0.1% फॉर्मिक एसिड थियो।

नमूनाहरू एमएस द्वारा अर्बिट्राप भेलोस प्रो मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।अन्तिम nanoâ HPLC प्रणाली (Dionex), अनुकूलन अन्त माउन्ट 50 सेमी संग सुसज्जित??75 μm C18 RP स्तम्भ 2.4 μm चुम्बकीय मोती (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) ले भरिएको प्रोक्सियन न्यानोस्प्रे स्रोत मार्फत अनलाइन मास स्पेक्ट्रोमिटरमा जडान गर्नुहोस्;300 µm भित्री व्यास ×??1 सेमी C18 PepMap पूर्व एकाग्रता स्तम्भ (थर्मो वैज्ञानिक)।पानी/०.०५% फोर्मिक एसिडलाई विलायकको रूपमा प्रयोग गरेर, नमूनालाई 6 μL/मिनेटको प्रवाह दरमा स्वचालित रूपमा फँसियो र डिसेलिनेट गरियो।

पानी/0.05% फोर्मिक एसिड (सल्भेन्ट ए) र 80% एसिटोनिट्रिल/0.045% फर्मिक एसिड (सल्भेन्ट बी) को निम्न ढाँचाहरू 300 एनएल/मिनेटको प्रवाह दरमा ट्रिप्टिक पेप्टाइड्सको पृथकीकरण प्राप्त गर्न प्रयोग गरियो: 4% बी को लागि। 5 मिनेट, त्यसपछि 30 A रैखिक ग्रेडियन्ट मिनेट भित्र 45% B मा, र 5 मिनेट भित्र 95% विलायक B मा रेखीय वृद्धि।क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भलाई स्टेनलेस स्टील न्यानो-एमिटर (प्रोक्सियन) मा जडान गर्नुहोस्, र 2,300 V को सम्भाव्यता प्रयोग गरी मास स्पेक्ट्रोमिटरको तातो केशिकामा सिधै एल्युन्ट स्प्रे गर्नुहोस्। Orbitrap मास विश्लेषकमा 60,000 को रिजोलुसन भएको सर्वेक्षण स्क्यान सम्बन्धित छ। कम्तिमा तीन डाटा MS/MS स्क्यानहरू, 30 सेकेन्डका लागि गतिशील रूपमा बहिष्कृत, रैखिक आयन ट्र्याप टक्कर प्रेरित पृथकीकरण वा उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण प्रयोग गरेर अर्बिट्राप पत्ता लगाउनेसँग, रिजोल्युसन 7,500 हो।